微芯片電泳在二代測(cè)序（NGS）文庫質(zhì)控的應(yīng)用
隨著測(cè)序價(jià)格不斷降低，NGS的應(yīng)用現(xiàn)在可以說是如日中天了，市場(chǎng)中主流NGS系統(tǒng)，如Hiseq，Solexa，454等，越來越多的進(jìn)入到大家的視野中。為了得到良好準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果，NGS前要求了解測(cè)序文庫樣品的尺寸分布和濃度，以提高測(cè)序的準(zhǔn)備性、減少測(cè)序過程中不必要的嘗試、降低測(cè)序成本。
傳統(tǒng)的方法是使用瓊脂糖凝膠電泳獲得文庫的尺寸分布，文庫的濃度信息則是通過實(shí)時(shí)熒光PCR或分光光度計(jì)獲得。這樣的操作需要一系列的步驟、繁瑣費(fèi)時(shí)、效率低下、成本居高不下。
另外，隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，需要進(jìn)行質(zhì)量控制的文庫數(shù)量大大增多！
本文承接上文，繼續(xù)介紹微芯片電泳在NGS文庫構(gòu)建中樣品分析的應(yīng)用，以期為大家提供一種操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、高通高、成本可接受的方法。
分析方法（與實(shí)時(shí)PCR 的濃度定量結(jié)果的比較）：
1、利用SMARTer Ultra Low RNA kit 制備cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物得到小鼠的TotalRNA
2、根據(jù)Illumina 公司的方法，分享cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物后，使用TruSeq DNA sample prep kit 制備NGS 文庫
3、使用微芯片電泳系統(tǒng)及自帶彌散（smear）分析軟件分析同一文庫，同時(shí)對(duì)濃度進(jìn)行定量
4、微芯片電泳系統(tǒng)的濃度定量結(jié)果和同一樣品的實(shí)時(shí)PCR（GVP-9600 qPCR）結(jié)果進(jìn)行比較
圖2. NGS 流程和MultiNA 文庫質(zhì)量控制的應(yīng)用范圍
結(jié)果討論：
在NGS文庫的質(zhì)量控制過程中，使用微芯片電泳的smear分析軟件能夠計(jì)算出文庫的預(yù)計(jì)平均大小、濃度和摩爾濃度（下圖）。通過與實(shí)時(shí)PCR 的定量進(jìn)行比較，可知MultiNA 的定量濃度定量結(jié)果穩(wěn)定（下表）。
| Library No. |
MultiNA (nmol/L) |
GVP-9600 (nmol/L) |
Ratio (MultiNA/GVP-9600) |
| 1 |
154.6 |
167.3 |
92.40% |
| 2 |
127.0 |
145.1 |
87.50% |
| 3 |
54.1 |
57.8 |
93.60% |
| 4 |
272.4 |
292.3 |
93.20% |
| 5 |
187.3 |
226.8 |
82.60% |
| 6 |
207.5 |
229.3 |
90.50% |
| 7 |
230.3 |
256.8 |
89.70% |
| 8 |
157.0 |
181.9 |
86.30% |
|
|
Average |
89.475% (CV 4.3 %) |
在小鼠的RNA 測(cè)序結(jié)果中，也得到了足夠的讀取長(zhǎng)度和Index標(biāo)簽序列的各文庫間穩(wěn)定的讀取率（下表）。
|
簇密度讀取數(shù)
（過濾處理后）
|
548 K/mm2
143.3 M reads
|
總讀取數(shù)
≧Q30 比率
|
151.5 M reads
95.90%
|
| 4 個(gè)文庫的讀取率 |
21.2% - 26.2%（4個(gè)文庫/用Index
標(biāo)簽序列對(duì)1個(gè)通道排序：理論值25 %） |
|
|
注：文庫制備時(shí)如果沒有進(jìn)行PCR，可能無法根據(jù)文庫的分布數(shù)據(jù)得到理想的檢測(cè)靈敏度。
由上述結(jié)果可知，不僅可以在MultiNA 的文庫質(zhì)量控制中確認(rèn)大小分布，還能夠在常規(guī)分析中同時(shí)進(jìn)行定量。使用MultiNA可最多對(duì)108 個(gè)文庫自動(dòng)進(jìn)行電泳和分析。并且，實(shí)際操作時(shí)間可縮短10～20 分鐘。特別是NGS 文庫有所增加時(shí)，將MultiNA應(yīng)用到文庫質(zhì)量控制中，可快速簡(jiǎn)便地進(jìn)行質(zhì)量控制。
MultiNA微芯片電泳系統(tǒng)進(jìn)行NGS文庫質(zhì)量控制的優(yōu)點(diǎn)：
|
