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轉(zhuǎn)染效率高 |
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蛋白表達(dá)水平高 |
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毒性低，可用于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染 |
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操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)染后無(wú)介質(zhì)變化要求 | | |
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將外源DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞已成為研究和控制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的重要工具，它可用于生化特性、突變分析以及細(xì)胞生長(zhǎng)行為的研究。此外，還被廣泛應(yīng)用于研究疾病的分子致病機(jī)制，包括遺傳與環(huán)境因子的復(fù)雜互作、新藥研究、基因診斷，疫苗及保健品的開發(fā)等。 |
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以下操作步驟以24孔板為例，遵循以下操作方法可以高效地將DNA轉(zhuǎn)染貼壁和懸浮培養(yǎng)的多種真核細(xì)胞。但是對(duì)某些特殊的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件，或特殊應(yīng)用等，也許需要單獨(dú)特別優(yōu)化，請(qǐng)參考表一至表三。 | |
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貼壁細(xì)胞數(shù)量：轉(zhuǎn)染前的18-24個(gè)小時(shí)，在24孔板的每個(gè)孔中加入500 μl含有0.6-1.3 x 105個(gè)細(xì)胞的無(wú)抗生素生長(zhǎng)培養(yǎng)基(確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在70-80%)。
懸浮細(xì)胞數(shù)量： 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，在24孔板的每個(gè)孔中加入500 μl含有1-2.5 x 105個(gè)細(xì)胞的無(wú)抗生素生長(zhǎng)培養(yǎng)基。注意確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有過(guò)度生長(zhǎng)或處于休止期。 | | |
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B. DNA/GBfectene-Elite轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備 | |
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1、將GBfectene-Elite轉(zhuǎn)染試劑放置于室溫中，使用前輕輕混勻。
2、將100 μl DMEM或其他培養(yǎng)液（無(wú)血清和無(wú)抗生素）加入無(wú)菌試管中。
3、在上述含有DMEM培養(yǎng)液的試管中加入0.5 μg 或1 μg待轉(zhuǎn)染的DNA質(zhì)粒等，并充分混勻。隨后在管子中加入經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的GBfectene-Elite 最佳用量（見(jiàn)重要提示4），快速渦旋混合使其完全混勻。
4、室溫靜置10分鐘，從而獲得100 μl DNA/GBfectene-Elite 轉(zhuǎn)染復(fù)合物（注：該轉(zhuǎn)染復(fù)合物在室溫下可保質(zhì)1 小時(shí)）。 | | |
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1、在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔不同部位逐滴加入100 μl DNA/GBfectene-Elite的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（由步驟B制備所得），輕輕前后晃動(dòng)培養(yǎng)板使其混勻。
2、放置在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、轉(zhuǎn)染24-48小時(shí)后，收集細(xì)胞，并按要求進(jìn)行檢測(cè)。 | | |
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圖一：GBfectene-Elite轉(zhuǎn)染試劑的操作流程 | |
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表一: 貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞接種數(shù)量、培養(yǎng)基體積 |
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| 培養(yǎng)器皿 |
每孔表面積(cm2) |
每孔相對(duì)面積 (vs. 96-孔板) |
每孔培養(yǎng)基的體積 (ml) |
貼壁細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天接種密度 |
懸浮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染
當(dāng)天接種密度1 |
| 96-孔板 |
0.32 |
1X |
0.1 |
1 - 2x104 |
2 - 5x104 |
| 48-孔板 |
0.75 |
2.3X |
0.2 |
2 - 5x104 |
0.4 - 1x105 |
| 24-孔板 |
2 |
6.3X |
0.5 |
0.6 - 1.3x105 |
1 - 2.5x105 |
| 12-孔板 |
4 |
13X |
1 |
1.3 - 2.6x105 |
2 - 5x105 |
| 6-孔板 |
9.5 |
30X |
2 |
3 - 6x105 |
0.4 - 1x106 |
| 60 mm |
21 |
66X |
5 |
0.6 - 1.3x106 |
1 - 2.5x106 |
| 100 mm |
56 |
175X |
10 |
1.8 - 3.5x106 |
2 - 5x106 | |
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注1：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)密度取決于培養(yǎng)器皿的表面積，而懸浮細(xì)胞的密度則由培養(yǎng)基體積決定，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在70-80% |
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表二: 對(duì)常規(guī)和敏感細(xì)胞起始轉(zhuǎn)染條件 |
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| 養(yǎng)器皿 |
每孔中培養(yǎng)基的體積 (ml) |
轉(zhuǎn)染復(fù)合物中 DNA含量范圍(µg) |
轉(zhuǎn)染稀釋液(無(wú)血清DMEM) 體積(µl) |
常規(guī)細(xì)胞每孔轉(zhuǎn)染試劑用量范圍 (µl)2 |
| 96-孔板 |
0.1 |
0.1 |
20 |
0.3 - 0.6 |
| 48-孔板 |
0.2 |
0.2 |
40 |
0.6 - 1.2 |
| 24-孔板 |
0.5 |
0.5-1 |
100 |
1.5 - 3.0 |
| 12-孔板 |
1 |
1-2 |
200 |
3.0 - 6.0 |
| 6-孔板 |
2 |
2-4 |
400 |
6.0 - 12 |
| 60 mm |
5 |
5-10 |
1000 |
15 - 30 |
| 100 mm |
10 |
10-20 |
2000 |
30 - 60 | |
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注2：GBfectene-Elite轉(zhuǎn)染試劑的用量在此范圍內(nèi)優(yōu)化 |
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表三: 使用 GBfectene-Elite成功進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的范例 |
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| 細(xì)胞類型 |
24孔板接種密度 |
每孔培基體積 (ml) |
轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA含量 (μg) |
轉(zhuǎn)染稀釋液(無(wú)血清DMEM) 體積(µl) |
GBfectene-Elite用量范圍(µl)3 |
| HEK293 293T |
1.3x105 |
0.5 |
0.5 |
100 |
2.0-3.0 |
| CHO-K1 |
0.9x105 |
0.5 |
0.5 |
100 |
1.5-2.5 |
| COS-7 |
1x105 |
0.5 |
0.5 |
100 |
1.5-2.5 |
| Hela |
0.9x105 |
0.5 |
0.5 |
100 |
1.5-2.0 |
| HepG2 |
0.9x105 |
0.5 |
1.0 |
100 |
2.0-3.0 |
| MCF-7 |
1.2x105 |
0.5 |
0.5 |
100 |
2.0-2.5 |
| NIH3T3 |
0.9x105 |
0.5 |
1.0 |
100 |
2.5-3.0 |
| RAW264.7 |
1.5x105 |
0.5 |
1.0 |
100 |
1.5-2.5 | |
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注3： 如果在轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，減少GBfectene-Elite轉(zhuǎn)染試劑的用量
| 編號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
產(chǎn)品價(jià)格（RMB） |
| GB1001-750 |
GBfectene -Elite 轉(zhuǎn)染試劑 |
0.75ml |
1700 |
| GB1001-1500 |
GBfectene -Elite 轉(zhuǎn)染試劑 |
1.5ml |
2800 |
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