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shRNA慢病毒包裝服務(wù)
一、慢病毒包裝服務(wù)介紹：
我們采用第三代慢病毒載體系統(tǒng)（詳見 慢病毒載體信息），病毒顆粒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多種細胞（包括分裂、非分裂細胞、難以轉(zhuǎn)染的細胞）、模式動物、活體實驗，且表達更趨穩(wěn)定。
shRNA慢病毒載體,最給力的RNAi工具：
在 siRNA表達載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA； 也可由載體直接表達發(fā)卡結(jié)構(gòu)小干擾RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通過構(gòu)建RNAi慢病毒顆粒制備shRNA，已成為進行RNA干擾實驗的最常用手段之一。 目前為了感染原代細胞和難感染的細胞系或者在動物水平進行RNAi，研究科學(xué)家更多的選擇了慢病毒載體。利用shRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時表達載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，shRNA慢病毒顆�？捎糜诟腥疽揽總鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達。
shRNA慢病毒顆粒具有以下優(yōu)勢：
轉(zhuǎn)染效率高且可以轉(zhuǎn)導(dǎo)入絕大多數(shù)細胞
shRNA慢病毒能用于分化細胞或靜息型哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染，包括難于轉(zhuǎn)染的原代細胞、干細胞、神經(jīng)細胞和內(nèi)皮細胞等，另外，我們的載體也可以用于knockdow動物和轉(zhuǎn)基因小鼠。
更好地分析目的基因的特點
與化學(xué)合成的siRNA相比， 利用shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后能夠避免合成的siRNA非有效轉(zhuǎn)染造成的殘余和損傷。慢病毒帶來的高效和無壓力轉(zhuǎn)染極大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。
長久性與可遺傳型RNA干擾
shRNA慢病毒感染細胞后可以整合到受感染細胞的基因組，穩(wěn)定長效表達miRNA, 這種RNA干擾具有可遺傳性，以便用于篩選穩(wěn)定細胞模型用于長期的研究和觀察。
慢病毒包裝簡要流程：
1、根據(jù)目的基因相關(guān)信息構(gòu)建shRNA重組慢病毒載體，提取和純化成超純純化重組質(zhì)粒；
2、使用重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TN 細胞，培養(yǎng)48 -72小時左右，進行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
3、純化和濃縮病毒液；
4、病毒滴度測定、目的基因檢定
慢病毒轉(zhuǎn)染效率：
MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個細胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高。 對于分裂活躍的細胞，比如Hela、293細胞，MOI=1時，80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進行實驗。
高度安全：
我們的慢病毒顆粒將生物安全性保證到了最大程度，其中HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國臨床基因治療的慢病毒， 專利號位美國Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR區(qū)域刪除了U3，使其不再有啟動/增強活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體，即整合到細胞基因組后，不會產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV雜交啟動子-R/U5’長末端重復(fù)序列）
采用雜合型RSV的增強子/啟動子-R/U5’長末端重復(fù)序列，這樣病毒轉(zhuǎn)錄時不依賴tat的存在，去除了 HIV的tat基因表達。，tat在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用
慢病毒骨架設(shè)計
僅保留了三個HIV-1病毒包裝、復(fù)制與轉(zhuǎn)導(dǎo)必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增強子啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出HIV RNA
慢病毒顆粒中無HIV-1基因
因為HIV-1表達的包裝質(zhì)粒都缺乏包裝信息，所以，慢病毒顆粒不具有復(fù)制能力
假病毒顆粒
慢病毒顆粒實為假病毒顆粒，只表達目的基因
水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成為野生型的可能性
二、我們的服務(wù)優(yōu)勢：
客制化載體構(gòu)建方案：
我們的服務(wù)方案包括根據(jù)目的基因特征以及要轉(zhuǎn)染細胞的特征與客戶需求，我們會為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動子、熒光標記或選擇性抗性標記，插入目的基因使其過表達，客戶也可以根據(jù)我們的載體信息自行挑選；同時又可以根據(jù)客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因或標簽（或進行改造），從而構(gòu)建高質(zhì)量的shRNA慢病毒載體，請參見 shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)。
多種慢病毒載體系統(tǒng)可供選擇：
我們用于shRNA慢病毒載體至少有十種以上可供客選擇，根據(jù)參考文獻以及目的應(yīng)用，我們總能幫客戶找到最合適實驗?zāi)康牡妮d體系統(tǒng)，而且每種慢病毒載體都具有相應(yīng)的文獻可追溯性（請參見 慢病毒載體信息）。
更合理、省心的服務(wù)流程：
我們會根據(jù)每個客戶的情況，為客戶獨身定制相應(yīng)的的服務(wù)流程，相比較而言，我們會根據(jù)客戶的實驗?zāi)康�，查閱大量的文獻以作參考；大規(guī)模包裝之前，會先小試，再在細胞水平驗證目的基因， 并且會跟客戶確認，讓技術(shù)服務(wù)更合理；客戶只需要告訴我們目的序列信息和細胞信息，我們會完成所有的服務(wù)，最后也提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)和資料，讓客戶更省心。
我們有以下標準服務(wù)方案如下，但是具體的實驗方案需要根據(jù)實際情況而定制，這里的標準流程僅供參考：
慢病毒濃縮：
我們使用SBI公司的PEG-it不會積累細胞殘片，避免了毒性和免疫反應(yīng)，對包括ES細胞在內(nèi)的所有靶細胞無毒。超速離心的過程中，也會濃縮其他雜質(zhì)，如細胞碎片、膜片段、以及細胞培養(yǎng)基內(nèi)的變性蛋白等。這些雜質(zhì)對于病毒顆粒的后繼操作是有害的，如降低細胞轉(zhuǎn)染效率，對轉(zhuǎn)染細胞的細胞毒性等，特別是當轉(zhuǎn)染原代細胞的時候。同時應(yīng)用于試驗動物的時候，會引發(fā)免疫反應(yīng)，因此在慢病毒的應(yīng)用過程中，不但需要較高的滴度，較高的純度也是很重要的。
慢病毒包裝服務(wù)儲存計劃：
我們會為客戶將定制好的慢病毒顆粒及載體做額外備份，免費儲存一段時間。以免客戶在后面的實驗中發(fā)生意外而急需。如有需要，也可以更優(yōu)惠的價格再次訂購。，詳情請參見慢病毒包裝服務(wù)儲存計劃。
技術(shù)力量：
我們的主要生產(chǎn)人員均為博士后或博士，我們生產(chǎn)人員常規(guī)包裝的慢病毒包裝顆粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、cDNA過表達慢病毒包裝服務(wù)列表：
cDNA過表達慢病毒包裝服務(wù)列表：
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編號 |
慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
工作日 |
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P200001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P200002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P200003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P200006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實驗、干細胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
說明：FIV來源的載體只能包裝成常規(guī)滴度的慢病毒
對照慢病毒顆粒：
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服務(wù)編號 |
對照慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
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P200007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P200008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P200009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實驗、干細胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
*用cDNA過表達病毒顆粒做對照，請詳見cDNA基因過表達慢病毒包裝服務(wù)。
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編號 |
shRNA慢病毒載體陰性對照 |
標準 |
主要特征 |
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S200008 |
pGreenPuro Scramble Hairpin Control |
10 μg超純純化 |
GFP和Puro雙標簽 |
四、成功案例與參考文獻：
成功案例：
HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.
參考文獻：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
