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shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)

shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)

shRNA慢病毒載體，最給力的RNAi工具：

在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)發(fā)卡結(jié)構(gòu)小干擾RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通過構(gòu)建RNAi慢病毒表達(dá)載體制備shRNA，已成為進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)的最常用手段之一。

目前為了感染原代細(xì)胞和難感染的細(xì)胞系或者在動(dòng)物水平進(jìn)行RNAi，研究科學(xué)家更多的選擇了慢病毒載體。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，lentivirus－shRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。

shRNA慢病毒載體具有以下優(yōu)勢(shì)：

轉(zhuǎn)染效率高且可以轉(zhuǎn)導(dǎo)入絕大多數(shù)細(xì)胞

shRNA慢病毒載體能用于分化細(xì)胞或靜息型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，包括難于轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，另外，我們的載體也可以用于knockdow動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因小鼠。

更好地分析目的基因的特點(diǎn)

與化學(xué)合成的siRNA相比，利用慢病毒構(gòu)建的shRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠避免合成的siRNA非有效轉(zhuǎn)染造成的殘余和損傷。慢病毒帶來的高效和無壓力轉(zhuǎn)染極大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。

長(zhǎng)久性與可遺傳型RNA干擾

包裝成慢病毒后感染細(xì)胞，可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，穩(wěn)定長(zhǎng)效表達(dá)miRNA, 這種RNA干擾具有可遺傳性，以便用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞模型用于長(zhǎng)期的研究和觀察。

shRNA慢病毒載體特點(diǎn)：

我們采用的美國(guó)進(jìn)口第三代HIV或FIV來源的慢病毒載體屬于自我滅活型載體，在長(zhǎng)效穩(wěn)定表達(dá)siRNA的同時(shí)又能保證高度安全，詳情請(qǐng)參見慢病毒載體信息，我們的shRNA慢病毒載體優(yōu)勢(shì)有：

1、含有H1/U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的HIV慢病毒載體保證能包裝出高滴度的慢病毒；

2、RNA單啟動(dòng)子系列高效表達(dá)shRNA，而RNA雙啟動(dòng)子直接表達(dá)雙鏈siRNA；

3、通T2A肽鏈linker基因同時(shí)表達(dá)GFP和Puro兩個(gè)標(biāo)簽，后續(xù)細(xì)胞篩選更容易；

4、多種能表達(dá)報(bào)告基因的啟動(dòng)子、含多個(gè)MSC位點(diǎn)或LCS無連接酶克隆位點(diǎn)、多種報(bào)告基因及抗性基因，選擇更靈活；

5、載體信息具有可追溯性，每種載體都具有對(duì)應(yīng)的國(guó)外參考文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)，便于文獻(xiàn)發(fā)表；

高效且安全：

HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國(guó)臨床基因治療的慢病毒，專利號(hào)為美國(guó)Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。所以，我們的shRNA慢病毒載體將生物安全性保證到了最大程度，是因?yàn)椋?/DIV>

U6和H1 RNA啟動(dòng)子

U6和H1 RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop）。

3 ΔLTR (ΔU3)

3’ LTR區(qū)域刪除了U3，使其不再有啟動(dòng)/增強(qiáng)活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體，即整合到細(xì)胞基因組后，不會(huì)產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對(duì)周圍基因的意外激活。

RSV/5’LTR （RSV雜交啟動(dòng)子-R/U5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列）

采用雜合型RSV的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子-R/U5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列，這樣病毒轉(zhuǎn)錄時(shí)不依賴tat的存在，去除了HIV的tat基因表達(dá)。，tat在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用。

結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

僅保留了三個(gè)HIV-1病毒包裝、復(fù)制與轉(zhuǎn)導(dǎo)必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增強(qiáng)子啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出HIV RNA 。

慢病毒顆粒中無HIV-1基因表達(dá)

因?yàn)镠IV-1表達(dá)的包裝質(zhì)粒都缺乏包裝信息，所以，慢病毒顆粒不具有自我復(fù)制能力。

假病毒顆粒

慢病毒顆粒實(shí)為假病毒顆粒，只表達(dá)目的基因。

水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜

限制病毒成為野生型的可能性。

說明：詳情請(qǐng)參見慢病毒載體信息

客制化服務(wù)方案：

目前我們能夠?yàn)榭蛻籼峁┌≧NAi靶序列設(shè)計(jì)、慢病毒載體構(gòu)建、測(cè)序、慢病毒生產(chǎn)等一站式服務(wù)，我們的服務(wù)將為客戶最大限度地提高效率和節(jié)省時(shí)間。另外，我們的技術(shù)專家將根據(jù)客戶提供背景資料共同探討服務(wù)的可行性和技術(shù)路線，請(qǐng)Email至[email protected].

同時(shí)，我們?yōu)榭蛻籼峁﹕hRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)的個(gè)性化定制服務(wù)方案：

1、根據(jù)目的mRNA序列，我們的專業(yè)人士使用專業(yè)siRNA設(shè)計(jì)軟件，為客戶設(shè)計(jì)出3-4條 RNA干擾靶序列，或根據(jù)客戶需求，設(shè)計(jì)更多RNAi靶序列；

2、針對(duì)不同的靶細(xì)胞，不同的病毒載體感染效率有差別。我們會(huì)幫客戶先進(jìn)行預(yù)試和篩選出最合適的載體，客戶也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)自行挑選出合適的載體；

3、可以根據(jù)客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報(bào)告基因、各種抗性標(biāo)簽或進(jìn)行改造，從而構(gòu)建shRNA慢病毒載體。

雖然我們有標(biāo)準(zhǔn)的客制化服務(wù)流程，但是我們會(huì)根據(jù)客戶需求，為每個(gè)客戶度身定制各種shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)方案。如有需要，歡迎致電021-34512321 咨詢。

標(biāo)準(zhǔn)客制化服務(wù)流程：

shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)列表：

我們可以根據(jù)客戶需求構(gòu)建4條以上的RNAi靶序列以及其各種濃度的超純純化shRNA慢病毒載體。構(gòu)建的重組shRNA慢病毒載體可直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；也可以包裝成病毒顆粒，用于shRNA的穩(wěn)定長(zhǎng)效表達(dá)。

超純純化標(biāo)準(zhǔn)：

內(nèi)毒素<10EU/mg質(zhì)粒DNA

RNA<0.2ug/mg

基因組DNA<2ug/mg

蛋白<3ug/mg

編號(hào)	shRNA慢病毒載體構(gòu)建	標(biāo)準(zhǔn)	工作日
S200001	1-3條靶序列	每種10 μg超純純化	10
S200002	1-3條靶序列	每種20 μg超純純化	10
S200003	1-3條靶序列	每種40 μg超純純化	10
S200004	4-10條靶序列	每種10 μg超純純化	15
S200005	4-10條靶序列	每種20 μg超純純化	15
S200006	4-10條靶序列	每種20 μg超純純化	15
S200007	10條靶序列以上	請(qǐng)咨詢	請(qǐng)咨詢

質(zhì)量保證：

您購買一套克�。ㄡ槍�(duì)一個(gè)基因的不同位置設(shè)計(jì)3-4條RNAi靶序列），在轉(zhuǎn)染效率>80%的前提下，我們保證至少有1-2個(gè)載體有效（可以達(dá)到至少70%轉(zhuǎn)錄水平的RNA干擾）。

shRNA慢病毒載體陰性對(duì)照：

編號(hào)	shRNA慢病毒載體陰性對(duì)照	標(biāo)準(zhǔn)	主要特征
S200008	pGreenPuro Scramble Hairpin Control	每種10 μg超純純化	GFP和Puro雙標(biāo)簽

成功案例：

HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.

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