cDNA基因過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)
一、慢病毒包裝服務(wù)介紹：
我們采用第三代慢病毒載體系統(tǒng)（慢病毒載體信息），病毒顆粒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多種細(xì)胞（包括分裂、非分裂細(xì)胞、難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、模式動(dòng)物、活體實(shí)驗(yàn)，且表達(dá)更趨穩(wěn)定。
慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：
1、根據(jù)目的基因相關(guān)信息構(gòu)建cDNA過表達(dá)重組慢病毒載體，提取和純化成超純純化重組質(zhì)粒；
2、使用重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TN 細(xì)胞，培養(yǎng)48 -72小時(shí)左右，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
3、純化和濃縮病毒液；
4、病毒滴度測(cè)定、目的基因檢定；
高度安全：
我們的慢病毒顆粒將生物安全性保證到了最大程度，其中HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國(guó)臨床基因治療的慢病毒， 專利號(hào)位美國(guó)Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR區(qū)域刪除了U3，使其不再有啟動(dòng)/增強(qiáng)活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體，即整合到細(xì)胞基因組后，不會(huì)產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對(duì)周圍基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV雜交啟動(dòng)子-R/U5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列）
采用雜合型RSV的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子-R/U5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列，這樣病毒轉(zhuǎn)錄時(shí)不依賴tat的存在，去除了 HIV的tat基因表達(dá)，tat在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用。
慢病毒骨架設(shè)計(jì)
僅保留了三個(gè)HIV-1病毒包裝、復(fù)制與轉(zhuǎn)導(dǎo)必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增強(qiáng)子啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出HIV RNA。
慢病毒顆粒中無HIV-1基因
因?yàn)镠IV-1表達(dá)的包裝質(zhì)粒都缺乏包裝信息，所以，慢病毒顆粒不具有復(fù)制能力。
假病毒顆粒
慢病毒顆粒實(shí)為假病毒顆粒，只表達(dá)目的基因。
水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成為野生型的可能性。
慢病毒轉(zhuǎn)染效率：
MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。 對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比如Hela、293細(xì)胞，MOI=1時(shí)，80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
二、我們的服務(wù)優(yōu)勢(shì)：
客制化載體構(gòu)建方案：
客制化載體構(gòu)建方案包括根據(jù)目的基因特征, 以及要轉(zhuǎn)染細(xì)胞的特征與客戶需求，我們會(huì)為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動(dòng)子、熒光標(biāo)記或選擇性抗性標(biāo)記，插入目的基因使其過表達(dá)，客戶也可以根據(jù)我們的載體信息自行挑選；同時(shí)又可以根據(jù)客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報(bào)告基因或標(biāo)簽（或進(jìn)行改造），從而構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA過表達(dá)慢病毒載體，請(qǐng)參見 cDNA過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)。
多種慢病毒載體系統(tǒng)可供選擇：
我們用于cDNA過表達(dá)的慢病毒載體至少有三十種以上可供客選擇，根據(jù)參考文獻(xiàn)以及目的應(yīng)用，我們總能幫客戶找到最合適實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡妮d體系統(tǒng)，而且每種慢病毒載體都具有相應(yīng)的文獻(xiàn)可追溯性（請(qǐng)參見 慢病毒載體信息）。
更合理、省心的服務(wù)流程：
我們會(huì)根據(jù)每個(gè)客戶的情況，為客戶獨(dú)身定制相應(yīng)的的服務(wù)流程，相比較而言，我們會(huì)根據(jù)客戶的實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，查閱大量的文獻(xiàn)以作參考；大規(guī)模包裝之前，會(huì)先小試，再在細(xì)胞水平驗(yàn)證目的基因， 并且會(huì)跟客戶確認(rèn)，讓技術(shù)服務(wù)更合理；客戶只需要告訴我們目的序列信息和細(xì)胞信息，我們會(huì)完成所有的服務(wù)，最后也提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)和資料，讓客戶更省心。
標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)流程如下，僅供參考：
慢病毒濃縮：
我們使用SBI公司的PEG-it不會(huì)積累細(xì)胞殘片，避免了毒性和免疫反應(yīng)，對(duì)包括ES細(xì)胞在內(nèi)的所有靶細(xì)胞無毒。超速離心的過程中，也會(huì)濃縮其他雜質(zhì)，如細(xì)胞碎片、膜片段、以及細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的變性蛋白等。這些雜質(zhì)對(duì)于病毒顆粒的后繼操作是有害的，如降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性等，特別是當(dāng)轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的時(shí)候。同時(shí)應(yīng)用于試驗(yàn)動(dòng)物的時(shí)候，會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，因此在慢病毒的應(yīng)用過程中，不但需要較高的滴度，較高的純度也是很重要的。
慢病毒包裝服務(wù)儲(chǔ)存計(jì)劃：
我們會(huì)為客戶將定制好的慢病毒顆粒及載體做額外備份，免費(fèi)儲(chǔ)存一段時(shí)間。以免客戶在后面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生意外而急需。如有需要，也可以更優(yōu)惠的價(jià)格再次訂購(gòu)，詳情請(qǐng)參見慢病毒包裝服務(wù)儲(chǔ)存計(jì)劃。
技術(shù)力量：
我們的主要生產(chǎn)人員均為博士后或博士，我們生產(chǎn)人員常規(guī)包裝的慢病毒包裝顆粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、cDNA過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)列表：
cDNA過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)列表：
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編號(hào) |
慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
工作日 |
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P100001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P100002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
|
P100003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P100004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
|
P100005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
|
P100006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
說明：FIV來源的載體只能包裝成常規(guī)滴度的慢病毒
對(duì)照慢病毒顆粒：
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服務(wù)編號(hào) |
對(duì)照慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
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P100007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P100008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P100009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
*說明：用RNAi病毒顆粒請(qǐng)見shRNA慢病毒包裝服務(wù)。
四、成功案例與參考文獻(xiàn)：
成功案例：
參考文獻(xiàn)：
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