MicroRNA knockdown慢病毒包裝服務
一、慢病毒包裝服務介紹：
MicroRNA（miRNA）即為長度為22nt左右的非蛋白編碼的調控小RNA家族。miRNA廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質，一般長20-24nt，miRNA的轉錄產物是發(fā)夾狀結構Pri-miRNA，在RNaseⅢ酶切后以雙鏈形式存在，最后釋放互補鏈，miRNA成熟。成熟的miRNA 側翼序列則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標志。miRNA基因是一類高度保守的基因家族，表達具有時序性和組織特異性。miRNA對生長發(fā)育進行更為重要的調控作用。同時，科學家們也發(fā)現(xiàn)人類基因組中大約有255個編碼miRNA基因，約占人類基因數(shù)的1%，但尚不清楚其功能。最近科學家發(fā)現(xiàn)小RNA 與‘epigenetic’現(xiàn)象有聯(lián)系。所謂epigenetic是指并不涉及遺傳序列的特征性的遺傳改變。有人已試圖將小RNA 用于抗病毒治療之用,認為它們有可有可能抑制HIV21 和灰質類病毒丙型肝炎病毒的轉錄,以及也可能用于腫瘤的治療。
我們采用第三代慢病毒載體系統(tǒng)（詳見 慢病毒載體信息），能夠高效表達出高效表達出不對稱發(fā)夾裝結構shRNA，這種shRNA能生成MicroRNA抑制劑，能特異性抑制內源性microRNA的功能。病毒顆粒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多種細胞（包括分裂、非分裂細胞、難以轉染的細胞）、模式動物、活體實驗，而且表達更趨穩(wěn)定。
高效表達miRNA抑制劑：
1、含組成型H1啟動子，持久且穩(wěn)定表達MicroRNA抑制劑.，實現(xiàn)永久性MicroRNA knockdown效應。
2、由于microRNA慢病毒載體能夠被包裝成microRNA慢病毒顆粒，用于感染分裂期和非分裂期細胞，如原代細胞、難于轉染的細胞或干細胞等。
3、這種MicroRNA knockdown效應能夠傳代，特別適合藥物篩選細胞株、病理組織與轉基因動物研究。
4、能夠明顯特異性抑制內源性MicroRNA的表達。
5、copGFP與Puro雙標簽形式，可用于穩(wěn)定陽性細胞株流式或抗性篩選。
6、MicroRNA抑制表達載體文庫可用于高通量表型篩選研究。
miRNA Knockdown原理：
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我們使用的載體能持續(xù)表達目的shRNA， 這種shRNA的上下部分不完全對稱（如下圖），上部分（灰色）不包含內源性miRNA， 而下部分經過剪切之后成短的、單鏈的microRNA抑制劑，能與內源性microRNA的靶mRNA序列完全互補結合，競爭性地抑制內源性microRNA的調節(jié)功能，從而使蛋白表達水平上調等。 |
慢病毒包裝簡要流程：
1、根據目的基因相關信息構建shRNA重組慢病毒載體，提取和純化成超純純化重組質粒；
2、使用重組載體和病毒包裝質粒共轉染293TN 細胞，培養(yǎng)48 -72小時左右，進行病毒包裝和生產，收集病毒液；
3、純化和濃縮病毒液；
4、病毒滴度測定、目的基因檢定
高度安全：
我們的慢病毒顆粒將生物安全性保證到了最大程度，其中HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國臨床基因治療的慢病毒， 專利號位美國Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR區(qū)域刪除了U3，使其不再有啟動/增強活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體，即整合到細胞基因組后，不會產生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV雜交啟動子-R/U5’長末端重復序列）
采用雜合型RSV的增強子&, lt;, /SPAN>/啟動子-R/U5’長末端重復序列，這樣病毒轉錄時不依賴tat的存在，去除了 HIV的tat基因表達。，tat在HIV-1基因組復制和轉錄延伸過程中發(fā)揮重要作用
慢病毒骨架設計
僅保留了三個HIV-1病毒包裝、復制與轉導必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增強子啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出HIV RNA
慢病毒顆粒中無HIV-1基因
因為HIV-1表達的包裝質粒都缺乏包裝信息，所以，慢病毒顆粒不具有復制能力
假病毒顆粒
慢病毒顆粒實為假病毒顆粒，只表達目的基因
水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成為野生型的可能性
二、我們的服務優(yōu)勢：
客制化載體構建方案：
我們的服務方案包括根據目的基因特征以及要轉染細胞的特征與客戶需求，我們會為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動子、熒光標記或選擇性抗性標記，插入目的基因使其過表達，客戶也可以根據我們的載體信息自行挑選；同時又可以根據客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因或標簽（或進行改造），從而構建高質量的MicroRNA knockdown慢病毒載體，請參見 microRNA knockdown慢病毒載體構建服務。
慢病毒載體優(yōu)化系統(tǒng)：
我們用于microRNA knockdown慢病毒載體有多種優(yōu)化過的優(yōu)勢元件，如T2A肽鏈，同時表達GFP和Puro兩個標簽，既可以用于流式篩選，也可以用于抗性篩選，根據參考文獻以及目的應用，我們總能幫客戶找到最合適的實驗方案，而且我們的慢病毒載體都具有相應的文獻可追溯性。
更合理、省心的服務流程：
我們會根據每個客戶的情況，為客戶獨身定制相應的的服務流程，相比較而言，我們會根據客戶的實驗目的，查閱大量的文獻以作參考；大規(guī)模包裝之前，會先小試，再在細胞水平驗證目的基因， 并且會跟客戶確認，讓技術服務更合理；客戶只需要告訴我們目的序列信息和細胞信息，我們會完成所有的服務，最后也提供相應的數(shù)據和資料，讓客戶更省心。
標準服務流程如下，僅供參考：
慢病毒濃縮：
我們使用SBI公司的PEG-it不會積累細胞殘片，避免了毒性和免疫反應，對包括ES細胞在內的所有靶細胞無毒。超速離心的過程中，也會濃縮其他雜質，如細胞碎片、膜片段、以及細胞培養(yǎng)基內的變性蛋白等。這些雜質對于病毒顆粒的后繼操作是有害的，如降低細胞轉染效率，對轉染細胞的細胞毒性等，特別是當轉染原代細胞的時候。同時應用于試驗動物的時候，會引發(fā)免疫反應，因此在慢病毒的應用過程中，不但需要較高的滴度，較高的純度也是很重要的。
慢病毒包裝服務儲存計劃：
我們會為客戶將定制好的慢病毒顆粒及載體做額外備份，免費儲存一段時間。以免客戶在后面的實驗中發(fā)生意外而急需。如有需要，也可以更優(yōu)惠的價格再次訂購，詳情請至慢病毒包裝服務儲存計劃。
技術力量：
我們的主要生產人員均為博士后或博士，我們生產人員常規(guī)包裝的慢病毒包裝顆粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、MicroRNA knockdown慢病毒包裝服務列表
miRNA Knockdown慢病毒包裝服務列表：
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編號 |
慢病毒產量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
工作日 |
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P400001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P400002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P400003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P400006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內實驗、干細胞應用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
說明：FIV來源的載體只能包裝成常規(guī)滴度的慢病毒
對照慢病毒顆粒：
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服務編號 |
pGreenPuro Scramble Hairpin Control |
可提供慢病毒數(shù)量 |
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P100007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P100008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P100009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內實驗、干細胞應用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
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*用MicroRNA過表達病毒顆粒做對照，請詳見MicroRNA過表達慢病毒包裝服務。
高水平表達miRNA抑制劑：
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miRZip重組載體表達高水平miRNA抑制劑
為了驗證microRNA重組載體的miRNA抑制劑表達水平，六種3μg載體轉染至HEK293細胞。培養(yǎng)48小時候之后，裂解細胞和提取總RNA，RNA樣本反轉錄成cDNA，最后用qPCR方法分析miRNA抑制劑的表達水平。
用qPCR驗證表達miRNA抑制劑的水平
反轉錄的cDNA 1:50稀釋，取1μl再加引物等制備成6μl qPCR反應體系，未轉染載體的細胞作為陰性對照，結果如左圖所示。
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四、成功案例與參考文獻
成功案例：
案例一：
miRNA抑制劑表達載體轉染HEK-293細胞，培養(yǎng)24小時之后加入8-50 μg/ml終濃縮嘌呤霉素，加入 嘌呤霉素24小時之后的結果如上圖所示，對照細胞在嘌呤霉素篩選全部死亡。
案例二：
用Lenti-miR-29a（過表達）慢病毒、miRZip-29a（Knockdown）慢病毒和陰性對照感染U937細胞，用WB檢測目標蛋白的表達水平，如下圖所示：miR-29的過表達下調目標蛋白；miRZip-29a抑制內源性miR-29a的表達，明顯上調目標蛋白表達水平。
案例三：
為了研究miR-21(癌基因發(fā)生相關miRNA)和miR-145（抑制腫瘤相關miRNA）在乳腺癌中表達的意義，分別用miRZip-21慢病毒、miRZip-145慢病毒與對照慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌細胞，再用Matrigel做細胞浸潤實驗來檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞的浸潤表型。
20小時之后，將已經侵入并貼附于微孔膜下層的細胞固定并0.05%結晶紫染色，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞數(shù)。下圖分別為對照病毒、miRZip-21 knockdown慢病毒和 miRZip-145 knockdown慢病毒處理過的穿過膜細胞視野圖。
實驗結果表明：對陰性對照相比，miRZip-21 knockdown慢病毒表達mir-21抑制劑能抑制80%的癌細胞生成；而miRZip-145能促進60%癌細胞生成。另外， miRZip-145慢病毒表達抑制內源性miRZip-145從而調節(jié)靶蛋白癌基因c-Myc的表達，WB結果如下圖所示：
參考文獻：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
