MicroRNA過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)
一、慢病毒包裝服務(wù)介紹：
MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。
我們采用第三代慢病毒載體系統(tǒng)（詳見 慢病毒載體信息），能夠高效表達(dá)出原始天然pri-miRNA和MicroRNA基因簇。病毒顆粒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多種細(xì)胞（包括分裂、非分裂細(xì)胞、難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、模式動(dòng)物、活體實(shí)驗(yàn)，而且表達(dá)更趨穩(wěn)定。
高效表達(dá)出天然pri-miRNA和MiRNA基因簇：
1、含CMV啟動(dòng)子高效表達(dá)出原始天然pri-miRNA，我們從人、大鼠、小鼠基因組或腫瘤組織中克隆出pri-miRNA，完全忠實(shí)細(xì)胞內(nèi)的天然結(jié)構(gòu)，具有更高的效率，更重要的是，它能在細(xì)胞內(nèi)準(zhǔn)確無誤地表達(dá)出天然microRNA。
2、隨著成千上萬條miRNA被鑒定出來，用microRNA干預(yù)基因功能或藥物篩選的需求越來越多。由于microRNA慢病毒顆粒能用于感染分裂期和非分裂期細(xì)胞，如原代細(xì)胞、難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或干細(xì)胞等，使其成為活體研究甚至基因治療的里程碑。
3、microRNA慢病毒顆粒感染過的細(xì)胞能夠長久表達(dá)miRNA，且這種表達(dá)具有可遺傳性，與化學(xué)合成的miRNA或表達(dá)miRNA質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)的瞬時(shí)表達(dá)相比，這種特點(diǎn)與天然的microRNA機(jī)制更相似。
4、copGFP與miRNA前體共同表達(dá)，可用于陽性細(xì)胞流式篩選與鑒定。
5、慢病毒可以表達(dá)完整MiRNA基因簇，可用于高通量表型篩選研究。
慢病毒包裝簡要流程：
1、根據(jù)目的基因相關(guān)信息構(gòu)建cDNA過表達(dá)重組慢病毒載體，提取和純化成超純純化重組質(zhì)粒；
2、使用重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TN 細(xì)胞，培養(yǎng)48 -72小時(shí)左右，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
3、純化和濃縮病毒液；
4、病毒滴度測定、目的基因檢定
慢病毒轉(zhuǎn)染效率：
MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。 對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞，比如Hela、293細(xì)胞，MOI=1時(shí)，80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
高度安全：
我們的慢病毒顆粒將生物安全性保證到了最大程度，其中HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國臨床基因治療的慢病毒，專利號(hào)位美國Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
3 ΔLTR (ΔU3)
3’ LTR區(qū)域刪除了U3，使其不再有啟動(dòng)/增強(qiáng)活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體，即整合到細(xì)胞基因組后，不會(huì)產(chǎn)生新的子代病毒，也降低了對(duì)周圍基因的意外激活。
RSV/5’LTR （RSV雜交啟動(dòng)子-R/U5’長末端重復(fù)序列）
采用雜合型RSV的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子-R/U5’長末端重復(fù)序列，這樣病毒轉(zhuǎn)錄時(shí)不依賴tat的存在，去除了 HIV的tat基因表達(dá)。，tat在HIV-1基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用
慢病毒骨架設(shè)計(jì)
僅保留了三個(gè)HIV-1病毒包裝、復(fù)制與轉(zhuǎn)導(dǎo)必需基因（gag, pol, rev) ，因其缺乏HIV-1增強(qiáng)子啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出HIV RNA
慢病毒顆粒中無HIV-1基因
因?yàn)镠IV-1表達(dá)的包裝質(zhì)粒都缺乏包裝信息，所以，慢病毒顆粒不具有復(fù)制能力
假病毒顆粒
慢病毒顆粒實(shí)為假病毒顆粒，只表達(dá)目的基因
水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
限制慢病毒成為野生型的可能性
二、我們的服務(wù)優(yōu)勢：
客制化載體構(gòu)建方案：
我們服務(wù)方案包括根據(jù)目的基因特征以及要轉(zhuǎn)染細(xì)胞的特征與客戶需求，我們會(huì)為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動(dòng)子、熒光標(biāo)記或選擇性抗性標(biāo)記，插入目的基因使其過表達(dá)，客戶也可以根據(jù)我們的載體信息自行挑選；同時(shí)又可以根據(jù)客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報(bào)告基因或標(biāo)簽（或進(jìn)行改造），從而構(gòu)建高質(zhì)量的MicroRNA過表達(dá)慢病毒載體，請參見 MicroRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)。
多種慢病毒載體系統(tǒng)可供選擇：
我們用于shRNA過表達(dá)的慢病毒載體有六種可供客選擇，根據(jù)參考文獻(xiàn)以及目的應(yīng)用，我們總能幫客戶找到最合適實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡妮d體系統(tǒng)，而且每種慢病毒載體都具有相應(yīng)的文獻(xiàn)可追溯性。
更合理、省心的服務(wù)流程：
我們會(huì)根據(jù)每個(gè)客戶的情況，為客戶獨(dú)身定制相應(yīng)的的服務(wù)流程，相比較而言，我們會(huì)根據(jù)客戶的實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，查閱大量的文獻(xiàn)以作參考；大規(guī)模包裝之前，會(huì)先小試，再在細(xì)胞水平驗(yàn)證目的基因， 并且會(huì)跟客戶確認(rèn)，讓技術(shù)服務(wù)更合理；客戶只需要告訴我們目的序列信息和細(xì)胞信息，我們會(huì)完成所有的服務(wù)，最后也提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)和資料，讓客戶更省心。
標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)流程如下，僅供參考：
慢病毒濃縮：
我們使用SBI公司的PEG-it不會(huì)積累細(xì)胞殘片，避免了毒性和免疫反應(yīng)，對(duì)包括ES細(xì)胞在內(nèi)的所有靶細(xì)胞無毒。超速離心的過程中，也會(huì)濃縮其他雜質(zhì)，如細(xì)胞碎片、膜片段、以及細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的變性蛋白等。這些雜質(zhì)對(duì)于病毒顆粒的后繼操作是有害的，如降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性等，特別是當(dāng)轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的時(shí)候。同時(shí)應(yīng)用于試驗(yàn)動(dòng)物的時(shí)候，會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，因此在慢病毒的應(yīng)用過程中，不但需要較高的滴度，較高的純度也是很重要的。
慢病毒包裝服務(wù)儲(chǔ)存計(jì)劃：
我們會(huì)為客戶將定制好的慢病毒顆粒及載體做額外備份，免費(fèi)儲(chǔ)存一段時(shí)間。以免客戶在后面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)生意外而急需。如有需要，也可以更優(yōu)惠的價(jià)格再次訂購。詳情請參見慢病毒包裝服務(wù)儲(chǔ)存計(jì)劃。
技術(shù)力量：
我們的主要生產(chǎn)人員均為博士后或博士，我們生產(chǎn)人員常規(guī)包裝的慢病毒包裝顆粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
三、cDNA過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)列表：
cDNA過表達(dá)慢病毒包裝服務(wù)列表：
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編號(hào) |
慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
工作日 |
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P300001 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P300002 |
>5*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>5*10^ 7~8 IFUs/ml |
30 |
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P300003 |
>1*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300004 |
>2*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>2*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300005 |
>4*10^8 IFUs/ml（高滴度） |
>4*10^ 8~9 IFUs/ml |
30 |
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P300006 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
30 |
說明：FIV來源的載體只能包裝成常規(guī)滴度的慢病毒
對(duì)照慢病毒顆粒：
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服務(wù)編號(hào) |
對(duì)照慢病毒產(chǎn)量 |
可提供慢病毒數(shù)量 |
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P100007 |
>1*10^7 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 7~8 IFUs/ml |
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P100008 |
>1*10^8 IFUs/ml（常規(guī)滴度） |
>1*10^ 8~9 IFUs/ml |
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P100009 |
>1*10^9 IFUs/ml（超高滴度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞應(yīng)用） |
>1*10^ 9~10 IFUs/ml |
*用MicroRNA knockdown病毒顆粒做對(duì)照，請?jiān)斠奙icroRNA knockdown慢病毒包裝服務(wù)。
表達(dá)出的MiRNA是內(nèi)源性MiRNA的幾倍：
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用HIV來源的Lenti-miR MicroRNA過表達(dá)載體包裝成病毒顆粒之后，感染HEK293細(xì)胞，表達(dá)的MicroRNA用qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用我們的慢病毒表達(dá)出MicroRNA是內(nèi)源性MicroRNA的幾倍以上。 |
共表達(dá)MiRNA基因簇：
microRNA(miRNA)基因簇是一類miRNA基因在染色體上成簇排列形成的基因群. 在動(dòng)植物基因組中，已發(fā)現(xiàn)存在大量簇生排列的miRNA基因。然而這種簇生排列方式所具有的功能意義尚不完全清楚. miRNA基因簇常位于一個(gè)多順反子內(nèi), 通過共表達(dá)在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化等諸多方面發(fā)揮協(xié)同調(diào)控的功能。
腫瘤和干細(xì)胞MicroRNA基因簇：
乳腺癌腫瘤干細(xì)胞MicroRNA基因簇：
四、成功案例與參考文獻(xiàn)：
13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>> |
