国产精品亚洲一区二区无码APP_日韩精品久久无码人妻中文字幕_三级高清在线观看播放_99精品视频免费_用力舒服好爽快点无码AV_国产精品午夜福利六区_亚洲中文精品免费看_国产麻豆日韩在线观看_无码乱伦先锋影音_免费在线观看a级毛片

 

MicroRNA與siRNA：     

  MicroRNA（miRNA）即為長度為22nt左右的非蛋白編碼的調(diào)控小RNA家族。miRNA廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質(zhì)，一般長20-24nt，miRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)Pri-miRNA，在RNaseⅢ酶切后以雙鏈形式存在，最后釋放互補鏈，miRNA成熟。成熟的miRNA 側(cè)翼序列則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標志。miRNA基因是一類高度保守的基因家族，表達具有時序性和組織特異性。miRNA對生長發(fā)育進行更為重要的調(diào)控作用。同時，科學家們也發(fā)現(xiàn)人類基因組中大約有255個編碼miRNA基因，約占人類基因數(shù)的1%，但尚不清楚其功能。最近科學家發(fā)現(xiàn)小RNA 與‘epigenetic’現(xiàn)象有聯(lián)系。所謂epigenetic 是指并不涉及遺傳序列的特征性的遺傳改變。有人已試圖將小RNA 用于抗病毒治療之用,認為它們有可能抑制HIV21 和灰質(zhì)類病毒丙型肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄,以及也可能用于腫瘤的治療。

 

1、二者的長度都約在22nt左右。

2、二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點。

3、二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。

4、二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導沉默機制上有重疊。

5、miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。

 

1、根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。

2、結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。

3、Dicer酶對二者的加工過程不同，miRNA是不對稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。

4、在作用位置上，miRNA主要作用于靶標基因3′-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5、在作用方式上，miRNA可抑制靶標基因的翻譯，也可以導致靶標基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導致靶標基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

6、miRNA主要在發(fā)育過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達，而siRNA不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。

 

 

  我們采用美國進口的第三代microRNA抑制表達慢病毒表達載體，能夠高效表達出不對稱發(fā)夾裝結(jié)構(gòu)shRNA，這種shRNA能生成 MicroRNA抑制劑，能特異性抑制內(nèi)源性microRNA的功能，詳情請見慢病毒載體信息。

 

1、含組成型H1啟動子，持久且穩(wěn)定表達MicroRNA抑制劑.，實現(xiàn)永久性MicroRNA knockdown效應。

2、由于microRNA慢病毒載體能夠被包裝成microRNA慢病毒顆粒，用于感染分裂期和非分裂期細胞，如原代細胞、難于轉(zhuǎn)染的細胞或干細胞等。

3、這種MicroRNA knockdown效應能夠傳代，特別適合藥物篩選細胞株、病理組織與轉(zhuǎn)基因動物研究。

4、能夠明顯特異性抑制內(nèi)源性MicroRNA的表達。

5、copGFP與Puro雙標簽形式，可用于穩(wěn)定陽性細胞株流式或抗性篩選。

6、MicroRNA抑制表達載體文庫可用于高通量表型篩選研究。

 

      

 

 

 

 

 

我們使用的載體能持續(xù)表目的shRNA， 這種shRNA的上下部分不完全對稱，如左圖， 上部分（灰色）不包含內(nèi)源性miRNA， 而下部分經(jīng)過剪切之后成短的、單鏈的microRNA抑制劑，能與內(nèi)源性microRNA的靶mRNA序列完全互補結(jié)合，競爭性地抑制內(nèi)源性microRNA的調(diào)節(jié)功能，從而使蛋白表達水平上調(diào)等。

  目前我們能夠為客戶提供包括miRNA表達譜分析、慢病毒載體構(gòu)建、測序、慢病毒生產(chǎn)等一站式服務。我們的服務將為客戶最大限度地提高效率和節(jié)省時間。另外，我們的技術專家將為您的實驗提供全程支持，請Email至[email protected]。

  同時，我們?yōu)榭蛻籼峁﹎iRNA抑制表達慢病毒載體構(gòu)建服務的個性化定制服務方案，包括根據(jù)miRNA抑制序列、mRNA特征、目的細胞特征與客戶需求，我們會為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動子、熒光標記或選擇性抗性標記，插入miRNA抑制序列，使其大量表達，客戶也可以根據(jù)我們的載體信息自行挑選；同時又可以根據(jù)客戶的需要，可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因或標簽（或進行改造），從而構(gòu)建miRNA knockdown慢病毒載體。

  我們有標準的客制化服務流程，同時我們也會根據(jù)客戶需求，為每個客戶度身定制各種MicroRNA knockdown慢病毒載體構(gòu)建服務方案。如有需要，歡迎致電021-34512321咨詢。

 

 

  我們可以根據(jù)客戶需求構(gòu)建各種濃度的超純純化miRNA抑制表達慢病毒載體。構(gòu)建的重組miRNA抑制表達慢病毒載體可直接轉(zhuǎn)染細胞，用于瞬時轉(zhuǎn)染；也可以包裝成病毒顆粒，用于穩(wěn)定長效表達。

 

                   內(nèi)毒素<10EU/mg質(zhì)粒DNA

                   RNA<0.2ug/mg

                   基因組DNA<2ug/mg

                   蛋白<3ug/mg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 為了驗證microRNA重組載體的miRNA抑制劑表達水平，六種3μg載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞。培養(yǎng)48小時候之后，裂解細胞和提取總RNA，RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用qPCR方法分析miRNA抑制劑的表達水平。

 

 

 

反轉(zhuǎn)錄的cDNA 1:50稀釋，取1μl再加引物等制備成6μl qPCR反應體系，未轉(zhuǎn)染載體的細胞作為陰性對照，結(jié)果如左圖所示。

 

 

 

  MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）是指每個細胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高。 對于分裂活躍的細胞，比如Hela、293細胞，MOI=1時，80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進行實驗。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

miRNA抑制劑表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，培養(yǎng)24小時之后加入8-50 μg/ml終濃縮嘌呤霉素，加入 嘌呤霉素24小時之后的結(jié)果如左圖所示，對照細胞在嘌呤霉素篩選全部死亡。

 

 

 

用Lenti-miR-29a（過表達）慢病毒、miRZip-29a（Knockdown）慢病毒和陰性對照感染U937細胞，用WB檢測目標蛋白的表達水平，如左圖所示：miR-29的過表達下調(diào)目標蛋白；miRZip-29a抑制內(nèi)源性miR-29a的表達，明顯上調(diào)目標蛋白表達水平。

 

 

 

 

 

 

為了研究miR-21(癌基因發(fā)生相關miRNA)和miR-145（抑制腫瘤相關miRNA）在乳腺癌中表達的意義，分別用miRZip-21慢病毒、miRZip-145慢病毒與對照慢病毒感染MDA-MB-231乳腺癌細胞，再用Matrigel做細胞浸潤實驗來檢測MDA-MB-231乳腺癌細胞的浸潤表型。

 

 

 

 

 

 

20小時之后，將已經(jīng)侵入并貼附于微孔膜下層的細胞固定并0.05%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞數(shù)。右圖分別為對照病毒、miRZip-21 knockdown慢病毒和 miRZip-145 knockdown慢病毒處理過的穿過膜細胞視野圖。

 

 

 

 

 

 

 

 

實驗結(jié)果表明：對陰性對照相比，miRZip-21 knockdown慢病毒表達mir-21抑制劑能抑制80%的癌細胞生成；而miRZip-145能促進60%癌細胞生成。另外， miRZip-145慢病毒表達抑制內(nèi)源性miRZip-145從而調(diào)節(jié)靶蛋白癌基因c-Myc的表達，WB結(jié)果如圖所示：

 

 

1、Katey J. Rayner, Yajaira Suárez, Alberto Dávalos, Saj Parathath, Michael L. Fitzgerald, Norimasa Tamehiro, Edward A. Fisher,Kathryn J. Moore, Carlos Fernández-Hernando. miR-33 Contributes to the Regulation of Cholesterol Homeostasis. Science. 2010 Jun 18;328(5985):1570-3.

2、Su X, Chakravarti D, Cho MS, Liu L, Gi YJ, Lin YL, Leung ML, El-Naggar A, Creighton CJ, Suraokar MB, Wistuba I, Flores ER. TAp63 suppresses metastasis through coordinate regulation of Dicer and miRNAs. Nature. 2010 Oct 21;467(7318):986-90.

3、Hassan MQ, Gordon J, A, Beloti MM, Croce CM, van Wijnen AJ, Stein JL, Stein GS, Lian JB. A network connecting Runx2, SATB2, and the miR-23a~27a~24-2 cluster regulates the osteoblast differentiation program. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Oct 27. [Epub ahead of print]. (PDF) »

4、Xia H, Cheung WK, Sze J, Lu G, Jiang S, Yao H, Bian XW, Poon WS, Kung HF, Lin MC. miR-200a regulates epithelial-mesenchymal to stem-like transition via ZEB2 and beta-catenin signaling. J Biol Chem. 2010 Nov 19;285(47):36995-7004. (PDF) »

5、Wilson KD, Hu S, Venkatasubrahmanyam S, Fu JD, Sun N, Abilez OJ, Baugh JJ, Jia F, Ghosh Z, Li RA, Butte AJ, Wu JC. Dynamic MicroRNA Expression Programs during Cardiac Differentiation of Human Embryonic Stem Cells: Role for miR-499. Circ Cardiovasc Genet. 2010 Aug 23. [Epub ahead of print].

6、Konstantinos J. Mavrakis, Andrew L. Wolfe, Elisa Oricchio, Teresa Palomero, Kim de Keersmaecker, Katherine McJunkin, Johannes Zuber, Taneisha James, Aly A. Khan, Christina S. Leslie, Joel S. Parker, Patrick J. Paddison, Wayne Tam, Adolfo Ferrando & Hans-Guido Wendel. Genome-wide RNA-mediated interference screen identifies miR-19 targets in Notch-induced T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Nature Cell Biology 12, 372 - 379 (2010).

7、Li QQ, Chen ZQ, Cao XX, Xu JD, Xu JW, Chen YY, Wang WJ, Chen Q, Tang F, Liu XP, Xu ZD. Involvement of NF-kappaB/miR-448 regulatory feedback loop in chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells. Cell Death Differ. 2010 Aug 27. [Epub ahead of print].

8、Angelo Veronese, Laura Lupini, Jessica Consiglio, Rosa Visone, Manuela Ferracin, Francesca Fornari,Nicola Zanesi, Hansjuerg Alder, Gemma DElia, Laura Gramantieri, Luigi Bolondi, Giovanni Lanza,Patrizia Querzoli, Adriano Angioni, Carlo M. Croce, and Massimo Negrini. Oncogenic Role of miR-483-3p at the IGF2/483 Locus. Cancer Research 70, 3140, April 15, 2010. (PDF) »

9、Lovén J, Zinin N, Wahlström T, Müller I, Brodin P, Fredlund E, Ribacke U, Pivarcsi A, Påhlman S, Henriksson M. MYCN-regulated microRNAs repress estrogen receptor-alpha (ESR1) expression and neuronal differentiation in human neuroblastoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 26;107(4):1553-8. (PDF) »

10、Hasan Rajabi,Caining Jin,Rehan Ahmad,Andrew Cain McClary,Maya Datt Joshi and Donald Kufe. Mucin 1 Oncoprotein Expression Is Suppressed by the miR-125b Oncomir. Genes and Cancer Jan 2010, vol. 1 no. 1 62-68. (PDF) »

11、Greene SB, Gunaratne PH, Hammond SM, Rosen JM. A putative role for microRNA-205 in mammary epithelial cell progenitors. J Cell Sci. 2010 Feb 15;123(Pt 4):606-618. (PDF) »